前言
由於B群鏈球菌（Group B Streptococcus, Streptococcus agalactiae, GBS，乙型鏈球 菌）可引起新生兒的肺炎(pneumonia)、腦膜 炎(meningitis)和敗血癥(sepsis)以及產(chǎn)婦敗血 癥及肺炎（圖1）[1, 2]，美國疾病控制與預防 中心(Centers for Disease Control and Prevention, CDC)建議懷孕35~37週之?huà)D女需進(jìn)行陰道
及/或肛門(mén)拭子的 GBS 檢測，以期在分娩前 施與抗生素。此措施成功地降低新生兒GBS 感染率達75%以上，也使致死率由1970年的 50%大幅下降至1990年的5% [3]。在臺灣， 衛生福利部國民健康署也為了提升產(chǎn)前GBS 檢查的普及率，於2014年 4 月起將 GBS 檢 測費納入健保給付[4]根據美國CDC建議以及衛福部國健署委 託臺灣醫事檢驗學(xué)會(huì )擬定的偵測B 群鏈球菌 標準作業(yè)流程[3, 5]（圖2），建議以無(wú)菌棉拭 自陰道及/或直腸採檢後插入嗜氧檢體運送管 (aerobic transport medium)，送到檢驗室後，先劃種血瓊脂平板(BAP)，再將棉拭插入Lim broth（純增菌用）或carrot broth（增菌與鑑 別用），在35℃一般恆溫箱培養18~24小時(shí) 後，若 BAP 上有疑似 GBS 的 -溶血型菌落 則需進(jìn)行CAMP (Christie, Atkins, and MunchPetersen)、hippurate（馬尿酸）水解或鏈球 菌分群試驗加以確認，如無(wú)發(fā)現疑似菌落， 則再將 Lim broth 增菌液再次移種一血瓊脂 平板，所有培養基均繼續培養18~24小時(shí)， 再發(fā)出最終報告。若接種carrot broth，則檢 視其是否顯色，若呈胡蘿蔔色即可報告為GBS 陽(yáng)性，若呈陰性，則再接種 GBS DetectTM （Hardy公司，美國），若有 -溶血型菌落， 則需如同Lim broth所移種BAP上的疑似菌 落進(jìn)行確認試驗，如無(wú)發(fā)現疑似菌落，則所 有培養基均繼續培養18~24小時(shí)，再發(fā)出最 終報告。

雖然美國CDC及衛福部國健署的建議流 程可將 GBS 的檢驗標準化，但所用的 Lim broth增菌培養基方法需經(jīng)過(guò)多次移種培養確 認，將會(huì )延遲報告3~4天[6]，而carrot broth 的接種需加一條促進(jìn)產(chǎn)色紙條[7]，以及所建 議移種的 GBS DetectTM 偽陽(yáng)性高達58% (62/107) [8]，造成檢驗人員的不便以及鑑定 人力與物力的浪費。由於使用嗜氧檢體運送 管運送檢體不能立即增菌，並可能讓產(chǎn)道或 腸道棲息菌增生進(jìn)而干擾GBS的檢出。有鑑 於上述美國CDC及衛福部國健署建議方法的 諸多缺點(diǎn)，啟新生物科技有限公司（新北市， 臺灣）遂設計孕婦產(chǎn)前檢查B 群鏈球菌的簡(jiǎn) 易高效快檢套組，其係由運送裝置 CMPTM GBS TransCultSwab（GBS 的運送增菌培養 管）[9]結合 / GBS detection agar（偵測瓊 脂）[10] / GBS carrot agar（GBS 胡蘿蔔瓊脂）[11]分隔平板(Bi-plate)而組成，此套組以 簡(jiǎn)易操作、高檢出率（分離率）及可縮短報 告時(shí)間與減少檢驗人員操作人力做為訴求。 本研究將評估 GBS TransCultSwab 結合 / GBS detection agar / GBS carrot agar分隔平 板的移種以確認其在臨床實(shí)際應用的有效性。

材料與方法 :

GBS檢驗套組的組成 GBS 簡(jiǎn)易高效快檢套組的組成包括 CMPTM GBS TransCultSwab[9]與 / GBS detection agar[10] / GBS carrot agar[11]分隔平板，每一個(gè)孕婦使用一支GBS TransCultSwab 及一個(gè)分隔平板，分別介紹如下： GBS TransCultSwab（圖3A）：GBS TransCultSwab（專(zhuān)利證書(shū)I627277號）是一 種結合採檢、運送、增菌與GBS假設性鑑定 四種功能的裝置，包裝中含有一支塑膠管， 內含可讓 GBS 增菌與即時(shí)抑制其它產(chǎn)道/直 腸棲息菌生長(cháng)的培養基配方，以及使GBS的 -溶血株生長(cháng)後顯色的成份，以半固體的方式 配製以利運送；裝置中另附一支無(wú)菌棉拭作 為採集產(chǎn)道及/或直腸分泌物檢體之用。醫師 採檢時(shí)將棉拭取出插入產(chǎn)道及（或）直腸約 2~3公分處旋轉兩圈採取足量分泌物後插至 含增菌培養基的塑膠管中，在室溫或35℃恆 溫箱暫時(shí)保存，然後在最短的時(shí)間內送至微 生物檢驗室，檢驗室收到此運送裝置，登記 相關(guān)資料後，置於35℃的一般或 CO2 恆溫 箱，培養5~24小時(shí)後可在任何時(shí)間內取出棉 拭移種至套組的分隔平板。 / GBS detection agar / GBS carrot agar 分隔平板：分隔平板中的 GBS carrot agar（專(zhuān)利證書(shū)I627277號）係針對GBS 溶血型菌株的偵測而設計的固體培養基，GBS carrot agar 含有特殊顯色基元可讓 -溶血型 GBS 的生長(cháng)菌落呈胡蘿蔔色（圖3B 的右半 邊，呈米白色）， / GBS detection agar（專(zhuān) 利證書(shū)I561634號）係針對GBS -溶血型菌 株的偵測而設計。含有綿羊血與特殊的溶血 加強液，可讓 -溶血型菌落轉變成 -溶血型 （圖3C的左半邊，呈紅色），而其接種方法 （圖3 之操作流程）為取出 GBS Trans CultSwab 的棉拭劃種分隔平板的兩邊各約 1/3，然後利用接種環(huán)操作三區劃線(xiàn)技術(shù)，最 後在分隔平板的第一區培養基各插種5~7次， 接著(zhù)放在35℃的一般或CO2恆溫箱培養20~48 小時(shí)。由於其它少數菌在 / GBS detection agar 的生長(cháng)菌落亦同樣地呈 -溶血，因此， 培養後任何懷疑的生長(cháng)菌落需再進(jìn)行適當的鑑定試驗（如CAMP試驗、馬尿酸試驗或血 清分群試驗）加以確認。
以臨床檢體實(shí)際評估GBS簡(jiǎn)易高效快檢套組 從 2016年 4 月 1 日至2017年 3 月 31日 止，新北市某醫事檢驗所以CMPTM GBSTrans CultSwab 採檢744個(gè)產(chǎn)前 GBS 檢查檢體， 採集依產(chǎn)科門(mén)診的作業(yè)習慣暫時(shí)保存在室溫 或 35℃的一般或5 % CO 2 恆溫箱，再以常溫 方式運送至微生物檢驗室，放入35℃的一般 或 5% CO2 恆溫箱培養5~24小時(shí)。若中午前 收到檢體，則培養後在下班前一小時(shí)移種至 含 / GBS detection agar / GBS carrot agar 的分隔平板；若在中午後收到檢體，則培養 至次日早上移種。移種的方式如上述的分隔 平板使用說(shuō)明。接著(zhù)，將GBS TransCultSwab 與分隔平板培養置入35℃的一般或CO2 恆溫 箱培養20~48 小時(shí)，然後進(jìn)行判讀，若在 GBS carrot agar的生長(cháng)菌落呈橘～紅色，且 在 / GBS detection agar呈現 -溶血現象即 可鑑定為GBS（圖3B及表1），又若在GBS carrot agar的生長(cháng)菌落不呈色，但在 / GBS detection agar 呈現 -溶血現象（圖3C 及表 1），則必須操作必要的鑑定試驗（如CAMP 試驗、馬尿酸試驗或血清分群試驗）加以確 認。
GBS 簡(jiǎn)易、高效及快檢技術(shù)所用套組與傳統 檢驗方法的成本與效能比較 以操作100個(gè)產(chǎn)前GBS檢查檢體為例， 假設 GBS 陽(yáng)性率為20%，將所評估的 GBS 簡(jiǎn)易高效快檢套組與當前傳統檢驗方法進(jìn)行 成本、操作方式、效能等比較。
結果 以臨床檢體實(shí)際評估GBS簡(jiǎn)易高效快檢套組 利用 GBS 簡(jiǎn)易高效快檢套組（結合 CMPTM GBS TransCultSwab與 / GBS detection
agar / GBS carrot agar 分隔平板）在12個(gè)月 間共評估744 個(gè)臨床產(chǎn)前檢查檢體，結果發(fā) 現孕婦的 GBS 檢出率(陽(yáng)性率)為 24.32% (181/744)，月的檢出率約介於18.60%~33.33%。 （表2）
GBS 簡(jiǎn)易、高效及快檢套組與公告的傳統檢 驗方法、成本與效能比較 以操作100個(gè)產(chǎn)前 GBS 檢查檢體為例，假設GBS陽(yáng)性率為20%，將GBS簡(jiǎn)易、高效 快檢套組與公告的傳統的 GBS 檢測方法進(jìn)行 成本與效能比較，傳統檢測方法為利用嗜氧 運送管採檢及運送，送至檢驗室後接種血平 板或顯色平板(CHROMagar StrepB)以及Lim broth或carrot broth，培養後進(jìn)行判讀，結果 顯示 GBS 簡(jiǎn)易高效快檢套組在操作時(shí)間、檢 出率、報告時(shí)效、成本以及簡(jiǎn)易性等項目皆 優(yōu)於公告的傳統GBS檢測方法。（表3）。

討論

GBS 的孕婦帶原者約為15~30%[12-17]， 醫師對帶原者常用的預防用藥為 penicillin [3]，其施用時(shí)機為分娩前4 小時(shí)，但若孕婦 對其過(guò)敏，則檢驗室需提供其它適當藥物的 藥敏型式。又如果發(fā)生早產(chǎn)，羊水提早破裂， 胎兒很可能因此受到感染。因此在孕婦產(chǎn)前 GBS檢查的正確性與快速性對預防性抗生素 的應用將具有重要性。 傳統孕婦產(chǎn)前GBS檢驗方法為採檢後送 至檢驗室立即接種BAP或其它選擇區分性顯 色瓊脂（如CHROMagar StrepB），然而兩 者 GBS 檢出率不高，僅為7.5%[18]以及 9.7~11.8%[19]，且BAP 與顯色平板生長(cháng)菌落 對 GBS 均不具有特異性，前者為滋養培養 基，革蘭氏陽(yáng)性及陰性菌都可以生長(cháng)，而後 者有許多其它菌如Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes (GAS)、Group G Streptococcus (GGS)、Staphylococcus aureus、 S. epidermidis與Stenotrophomonas maltophilia 的生長(cháng)菌落也呈現與GBS同樣的紫色菌落形態(tài)，而無(wú)法彼此區分，CHROMagar StrepB 顯色瓊脂的特異性?xún)H達70% (24/40)[11]，此 發(fā)現與CHROMagar StrepB顯色瓊脂的使用 說(shuō)明一致[20]。因此，在實(shí)際應用時(shí)，任何紫 色菌落在CHROMagar StrepB的出現還需進(jìn) 行 CAMP 或 hippurate 水解等鑑定試驗以確 認分離菌為GBS，此額外試驗將延遲檢驗報 告 1 天，也更浪費人力及物力。另外，林等 [21]以 PCR DNA方法檢測晚孕期陰道B 群鏈 球菌的定植分別發(fā)現其檢出率為14.1% (288/1,472)，而楊等[22]及季等[23]應用即時(shí)螢 光定量PCR技術(shù)指出GBS的陽(yáng)性率為13.5% (85/600)與 4.17% (377/9,073)。分子診斷技 術(shù)雖然快速獲得檢測結果，但檢出率不高， 且萃取檢體中的菌體DNA，不僅費時(shí)、成本 高、須有昂貴的設備與良好的實(shí)驗室環(huán)境以 及勝任的操作人員，且無(wú)法即時(shí)獲得進(jìn)行藥 敏試驗所需的GBS生長(cháng)菌落，美國的疾病管 制署(CDC)[3]並不建議使用分子檢測方法直 接從孕婦產(chǎn)前檢體偵測GBS。 本研究指出GBS簡(jiǎn)易、高效快檢套組證 實(shí) CMPTM GBS TransCultSwab具有採檢/運送/增菌及假設性鑑定 GBS 的效能，檢驗人 員的使用將不需再移種增菌培養基(Lim broth 或carrot broth)，也不需如同美國Hardy生產(chǎn) 的carrot broth需額外插入加強顯色紙條，因 此 GBS TransCultSwab的操作堪稱(chēng)簡(jiǎn)易、方 便與親民(user friendly)。另外，GBS Trans CultSwab移種的分隔平板中GBS carrot agar 偵測 -溶血型GBS的特異性高達100%[11]， 因此，任何橘~紅色的生長(cháng)菌落可藉著(zhù)顯色特徵快速檢出GBS。GBS除了 -溶血型外， 尚有3~5%屬於非( )溶血型[3]，此可藉者分 隔平板的 / GBS detection agar快速偵測， 因此，檢測套組對GBS的偵測是全面性的， 雖然美國Hardy Diagnostics已研發(fā)可用於偵 測 溶血型GBS的區分性培養基-GBS DetectTM （平板培養基），發(fā)現 溶血型 GBS 從孕婦 檢體的檢出率為3.9% (24/619)，但因其偽陽(yáng) 性高達58% (62/107)[8]，將導致檢驗人力的浪費及偽陽(yáng)性的產(chǎn)生，綜合以上及本研究之 臨床744件檢體測試結果，使用 GBS Trans CultSwab搭配 / GBS detection agar / GBS carrot agar 分隔平板的移種，對GBS偵測率 （檢出率）高達24.32%。（表2） 過(guò)去研究曾指出Enterococcus spp.（腸 球菌）的菌量高於 -溶血型GBS十倍時(shí)會(huì )干 擾（掩蓋或抑制） -GBS在 GBS carrot agar [11]和GBS TransCultSwab的顯色能力[24-26]。 推測Enterococcus spp.干擾 -GBS的原因可 能為其等同屬一個(gè)菌科，生長(cháng)條件相同，且 在增菌培養基的生長(cháng)速度相近之故，但在相 等菌量存在時(shí)則不影響顯色。目前尚無(wú)法從 配方的改變加以改善，但運送管增菌培養5 小時(shí)後，搭配 / GBS detection agar / GBS carrot agar的三區劃線(xiàn)法移種，將可隔離GBS 與 Enterococcus spp.，而避免後者的干擾 [25]， -GBS雖然在carrot agar不顯色，但可 在 / GBS detection agar產(chǎn)生 -溶血型菌落， 只要進(jìn)行必要的 CAMP、馬尿酸(hippurate) 水解或鏈球菌血清分群試驗將可立即加以區 分[10]。 孕婦產(chǎn)前檢查GBS分離率受到各種因素 影響[12]，包括(i) 醫師或護理師的採檢技術(shù)： 此因素影響GBS分離率最大，如果僅採集產(chǎn) 道，應該將棉拭深入產(chǎn)道內2 公分，慢慢旋 轉 2 圈已得到最大量的分泌物為原則；如果 用同一支棉拭採檢直腸部位檢體，也是操作 同樣的採檢技術(shù)。有些醫師欲分別得到產(chǎn)道 與直腸的檢體，則共取2 支無(wú)菌棉拭採檢。 (ii) 特殊增菌與分離培養基的使用：GBS 的 棉拭檢體不能直接接種平板培養基，必須先 經(jīng)過(guò)增菌，才能移種或操作real-time PCR。 增菌肉湯培養基包括carrot broth, Lim broth, Trans-Vag broth 以及本研究所建議的 GBS TransCultSwab，分離培養基則包括CHROMagar StrepB、BAP、CNA、PEA、GBS DetectTM以 及本研究所建議含 / GBS detection agar/ GBSCarrot agar的bi-plate，其中GBS DetectTM、 bi-plate 與 CHROMagar StrepB 均能測出 GBS，但因兩者偽陽(yáng)性高，因此均需要挑取 GBS懷疑菌落進(jìn)一步操作確認試驗（如CAMP 試驗）。(iii) GBS檢測的操作技術(shù)以及檢驗 人員的訓練與經(jīng)驗：如果直接將棉拭檢體接 種 BAP 等分離培養基或操作 PCR 等分生技 術(shù)，GBS分離率僅約7~10%左右；如果僅用 GBS TransCultSwab 的培養結果，在醫師正 確採檢技術(shù)及檢驗人員對判讀有6 個(gè)月以上 經(jīng)驗的條件下，GBS分離率為18.63% (30/161) [9]以及18.28%[21]，如果沒(méi)有足夠的判讀經(jīng) 驗，分離率約為11.03%[21]，因此，GBSTrans CultSwab 應該配合 / GBS detection agar/ GBS Carrot agar的 bi-plate的移種才能夠達 到本研究所顯示的高GBS分離率(24.32%)。 (iv) / GBS detection agar/ GBS Carrot agar 的bi-plate接種技術(shù)：由於是分隔培養基，因 此選用三區劃線(xiàn)技術(shù)，移種的第一區約佔表 面積的1/3，然後將接種環(huán)滅菌冷卻後再塗畫(huà) 第二區，同樣地，再次將滅菌環(huán)滅菌後再塗 畫(huà)第三區，最後在第一區插種5 次，以便獲 得無(wú)氧環(huán)境，更利於 -GBS 在 bi-plate 分別 產(chǎn)生橘-紅色[11]及產(chǎn)生 -溶血環(huán)。(v) 棉拭檢 體需有足夠的增菌時(shí)間：無(wú)論在carrot broth, Lim broth, Trans-Vag broth 以及GBS Trans CultSwab均需要培養在35~37℃的CO2 培養 箱，肉湯培養基須培養20~24小時(shí)，而GBS TransCultSwab則培養5~24小時(shí)，才能移種 至CHROMagar StrepB、BAP、CNA、PEA、 GBS DetectTM 之一的分離培養基。以及(vi) 延長(cháng)培養時(shí)間及再次移種：GBS 檢測的棉拭 檢體經(jīng)過(guò)增菌、移種及培養後如果沒(méi)有顯示 生長(cháng)，增菌培養基最好延長(cháng)培養一天，然後 再進(jìn)行平板培養基的移種及培養後的觀(guān)察。 總之，除了提高GBS的檢出率、有能力 偵測 -溶血型 GBS 以及避免 Enterococcus spp.的干擾外，本研究亦發(fā)現此套組的分隔平板在培養隔日即可鑑定出GBS，其陽(yáng)性生 長(cháng)菌落可隨即用於操作藥敏試驗，如此，將 可縮短至少一天的報告時(shí)間，並且GBS Trans CultSwab 運送管與 GBS carrot agar 上的顯 色及在 / GBS detection agar呈現的 -溶血 特徵將可做為三重複確認(triple-check) GBS 的存在，由於檢驗人員僅需移種一次，且花 費時(shí)間僅約15秒，對檢驗人員堪稱(chēng)方便，操 作人員僅需稍微訓練即能進(jìn)行檢驗工作，因 此，對臨床檢驗室而言，GBS TransCultSwab 結合 / GBS detection agar / GBS carrot agar 的移種將具備簡(jiǎn)易、快速及高通量(highthroughput)檢測的優(yōu)點(diǎn)，值得臨床檢驗室加 以應用，以便將陽(yáng)性檢驗結果即時(shí)提供醫師 做為預防新生兒與孕婦感染的參考。

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